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酵母发酵生产沙巴体育的研究

酵母发酵生产沙巴体育的研究

2018-06-23

沙巴体育是一种应用于食品营养特性改善的多元醇。它具有一些健康特性,如口感甘甜、低热 量、不提升血糖、改善肝功能等。另外,沙巴体育 在医药、动物营养等方面的应用也受到了人们的 关注。沙巴体育已经成为应用最广的功能性多元糖 醇。现在,工业上是通过将D-木糖化学加氢的 方法来生产沙巴体育的,这个过程需要在镍催化 剂、高温、高压的条件下进行。由于沙巴体育的传 统生产工艺流程较长、耗水量、排污量大,因此 发酵生产沙巴体育近年来受到了广泛的关注。从现 在的微生物发酵工艺来看,要实现规模化生产, 还需要通过代谢工程的优化。

生物法生产沙巴体育

沙巴体育是一种天然存在的稀有糖醇,在水 果、蔬菜、地衣苔藓、蘑菇等生物中都有少量的 存在。沙巴体育已经实现了规模化的生产m (图 1),并在食品、医药中得到了广泛的应用。用木 糖醇脱氢酶氧化沙巴体育可以生产L-木酮糖,L - 木酮糖在L-鼠李糖异构酶的催化下又可以生产L-来苏糖或L-木糖。L-木酮糖还可以生产L -核糖,在L-阿拉伯糖异构酶的作用下,L-核 糖又转化为L-阿拉伯糖。

作为具有工业化前景的生产途径之一,发酵生产沙巴体育首先需要弄明白其代谢途径以及微生 物在木糖等这些非常规培养基中的生长情况6-5 (表 1)。

酵母中的 Genera Candida, Pichia, ces和Pachysolen都可以用D -木酮糖来生产沙巴体育,它们的代谢途径经优化后,都可以获得较 的转化率0。

2木糖在酵母细胞中的运输

近年来的研究证明,Saccharomyce 在好氧条件下,以木糖为唯一碳源时,生长的十 分缓慢。进1步研究发现,Saccharomyces cere- visiae 有专门运输木糖的载体,从而导致它对木糖的利用十分缓慢。在起始研究木糖在酵母细胞中的运输时,选择了 P.stipitis, P. heedii, C. shehatae, and C. Intermedia 作为研究对象, 发现他们都存在两种对木糖的运输系统。

2.1促进传质系统

对应的基因例如,P. stipitis的SUT1 (糖运输 载体1)、C. intermedia的GXF1 (葡萄糖/木糖促进 传质1),组成性表达编码葡萄糖/木糖载体蛋白9。 2.2同向转移木糖质子系统GXS1 (葡萄糖/木糖同向转移载体基因)可 以在各种酵母和霉菌中编码单糖质子同向转移蛋白 。



在S. cerevisiae中,促进木糖传质系统代替 了由XHT (己糖转移载体)基因编码的转运蛋白 (图2)。在S. cerevisiae 中,木糖的运输效率比葡 萄糖低得多,因为运输蛋白(例如由基因XHT2, XHT6, XHT7编码的)具有与葡萄糖非常高的亲和力。

3木糖在酵母中的代谢

第一步,木糖首先在木糖还原酶(XR)的作用下,转化成代谢中间体一沙巴体育。XR是由 XYL1编码的,作用时需要利用NADH或NAD- PH。第二步,在沙巴体育脱氢酶(XDH)的作用 下,将沙巴体育转化成D -木酮糖。XDH是由 XYL2编码的,需要NAD +或NADP +做辅酶因 子(图 3) 12。因此,将 P. stipitis 或 C. tropi-calls 中的基因XYL1转入S. cerevisiae 中,就可以 让S. cerevisiae 生产沙巴体育了。



众所周知,对于发酵木糖生产乙醇,酵母具 有独特的优势。在厌氧或低氧浓度条件下,以 NADH或NADPH作辅助因子,利用木糖还原酶 将木糖还原成沙巴体育,同时产生的NAD +或 NADPH则进入下_步代谢途径,这样最终的产 物是乙醇,而没有沙巴体育的积累。如果酵母菌不 以NADH作辅助因子,不产生NAD+,这样在木 糖的第一步代谢中就可以积累沙巴体育(例如De-baryomyces hansenii)。

4酵母中影响沙巴体育生产的因子

酵母生产沙巴体育的发酵工艺受一系列因子的 影响和控制。例如:底物浓度,碳源,接种量, 浴氧,温度或pH。

4.1木糖浓度

实验证明,影响酵母生长和发酵过程的一个重要因素就是木糖的底物浓度。培养基中木糖的 浓度可以影响沙巴体育的生产。可以承受高渗透压 或高葡萄糖浓度的酵母,在较高的木糖浓度下木 糖醇的产量较高。在提高发酵培养基木糖浓度的 同时,也要提高溶氧量,避免对菌体生长的抑 制。在对C. tropicalis菌株进行试验研究时发现, 在高木糖浓度条件下,通过选择溶氧量,使细胞 在发酵初期得到良好的生长,沙巴体育的生产效率 就会得到有效的提高。

4.2碳源

试验证明,C. tropicalis在低葡萄糖浓度条件 下菌体可以获得良好的生长,葡萄糖消耗完后可 以再利用木糖生产沙巴体育。这种情况在其他一些菌种中也存在,但是在 C. Guilliermondii M中还 没有证实是否存在这种相似的结果。

4.3氮源

在品种繁多的氮源中,酵母膏和尿素是酵母生产沙巴体育的最佳营养剂。在研究C. Bo—菌 株时这些氮源的促进左右得到了有效的证实。

4. 4接种囷龄

发酵工艺受接种菌龄的影响比较大,因为这 可以影响细胞的代谢活性和生存能力。用C.Guilliermondii 生产沙巴体育时,接种培养24h的菌 种,木糖浓度54. 5g/L时,其积累沙巴体育的能力 可达到 o^sgi—i-1。

4.5溶氧

氧是酵母代谢木糖的关键因子,在厌氧条件 下,由木糖生产沙巴体育的代谢途径被完全关闭。 不同菌种在代谢木糖时耗氧量均有不同。例如, C. Tropcalis在半厌氧条件下沙巴体育的产率最高; 在米用D. Hansenii 菌株做试验时也得到了同样 的结果。在采用葡萄糖培养细胞时,为了获得高 的细胞浓度,因此保证供氧量是必须的措施。

4. 6温度和pH

试验发现最佳的发酵温度是在30°C左右,有 轻微的温度波动不会影响对沙巴体育的代谢积累。 但是当温度超过37C时,沙巴体育的生产效率会大 大降低。不同的菌种对培养基的初始pH有不同的要求。D. Hansenii 的最佳 pH 是 5.5,而 C.parapsilosis, C. guilliemondii 和 C. Boidinii 生长的 最佳pH值是4. 5〜5, 6.0和7.0。

5提高酵母沙巴体育产量的方法

利用不同的酵母均得到了天然代谢产生的沙巴体育,特别是 Candida genera, C. boidinii, C. guilliermondii, C. parapsilosis, , C. pelliculosa, C. shehatae, C. tropicalis16 以及相近的 De- baryomyces hansenii 和 Pichia stipitis 菌种,比较适 用于沙巴体育的生产。

虽然这些酵母的活性及生产沙巴体育的能力都 很好,但是在工业规模上还是存在了很多问题, 例如木糖的价格很高、发酵的成本较高等。因此 还需要采取很多措施来进行改进、优化生产工 艺,例如优化细胞生长条件、控制溶氧及氧化还 原能力,采用复合底物或抑制沙巴体育脱氢酶基因 (XYL2)的表达,以增强木糖还原酶的活力。

这些改善、优化的方法是基于以下提出的: 5.1化学和物理诱变技术

这样可以增加生产沙巴体育的菌株的数量,可 以采用甲基硝基亚硝基胍、紫外射线等作为诱变 剂不断进行试验,然后通过特殊的培养基就可以 选出沙巴体育产量高的菌株。

5. 2基因工程技术

除了可以消耗木糖生产沙巴体育的野生菌株(例如 C. boidinii, C. guilliermondii, C. tropica- lis, C. parapsilosis, D. hansenii) 17 18 ,现在报道中常见的生产沙巴体育的酵母菌株还有两大类。 (1)通过破坏其中的乙醇脱氢酶(ADH)或木糖 醇脱氢酶(XDH),而将木糖转变成沙巴体育的菌株;(2)重组酵母。例如将P. Stipitis, C. tropi- calis或C. parapsilosis中的木糖还原酶基因XYL1 转入到S. 中。这都是基因工程技术有效应用的结果。

K〇和他的团队20-21近期发现,通过破坏木 糖醇脱氢酶基因XYL2,可以阻止沙巴体育向木酮 糖的转化。通过复合培养基(最有效的是甘油) 可以促进细胞的生长和NADPH的产生,最终在 发酵16h后沙巴体育积累的浓度就达到了 48. 6g/L。 这样方法的有效性在P. 3stipitis中也得到了证实。 沙巴体育脱氢酶(XDH)缺陷性菌株,破坏由 XYL3编码的D - xylulokinase后,沙巴体育的积累 量可达到SSg/L122。


沙巴体育是一种应用于食品营养特性改善的多元醇。它具有一些健康特性,如口感甘甜、低热 量、不提升血糖、改善肝功能等。另外,沙巴体育 在医药、动物营养等方面的应用也受到了人们的 关注。沙巴体育已经成为应用最广的功能性多元糖 醇。现在,工业上是通过将D-木糖化学加氢的 方法来生产沙巴体育的,这个过程需要在镍催化 剂、高温、高压的条件下进行。由于沙巴体育的传 统生产工艺流程较长、耗水量、排污量大,因此 发酵生产沙巴体育近年来受到了广泛的关注。从现 在的微生物发酵工艺来看,要实现规模化生产, 还需要通过代谢工程的优化。

生物法生产沙巴体育

沙巴体育是一种天然存在的稀有糖醇,在水 果、蔬菜、地衣苔藓、蘑菇等生物中都有少量的 存在。沙巴体育已经实现了规模化的生产m (图 1),并在食品、医药中得到了广泛的应用。用木 糖醇脱氢酶氧化沙巴体育可以生产L-木酮糖,L - 木酮糖在L-鼠李糖异构酶的催化下又可以生产L-来苏糖或L-木糖。L-木酮糖还可以生产L -核糖,在L-阿拉伯糖异构酶的作用下,L-核 糖又转化为L-阿拉伯糖。

作为具有工业化前景的生产途径之一,发酵生产沙巴体育首先需要弄明白其代谢途径以及微生 物在木糖等这些非常规培养基中的生长情况6-5 (表 1)。

酵母中的 Genera Candida, Pichia, ces和Pachysolen都可以用D -木酮糖来生产沙巴体育,它们的代谢途径经优化后,都可以获得较 的转化率0。

2木糖在酵母细胞中的运输

近年来的研究证明,Saccharomyce 在好氧条件下,以木糖为唯一碳源时,生长的十 分缓慢。进1步研究发现,Saccharomyces cere- visiae 有专门运输木糖的载体,从而导致它对木糖的利用十分缓慢。在起始研究木糖在酵母细胞中的运输时,选择了 P.stipitis, P. heedii, C. shehatae, and C. Intermedia 作为研究对象, 发现他们都存在两种对木糖的运输系统。

2.1促进传质系统

对应的基因例如,P. stipitis的SUT1 (糖运输 载体1)、C. intermedia的GXF1 (葡萄糖/木糖促进 传质1),组成性表达编码葡萄糖/木糖载体蛋白9。 2.2同向转移木糖质子系统GXS1 (葡萄糖/木糖同向转移载体基因)可 以在各种酵母和霉菌中编码单糖质子同向转移蛋白 。



在S. cerevisiae中,促进木糖传质系统代替 了由XHT (己糖转移载体)基因编码的转运蛋白 (图2)。在S. cerevisiae 中,木糖的运输效率比葡 萄糖低得多,因为运输蛋白(例如由基因XHT2, XHT6, XHT7编码的)具有与葡萄糖非常高的亲和力。

3木糖在酵母中的代谢

第一步,木糖首先在木糖还原酶(XR)的作用下,转化成代谢中间体一沙巴体育。XR是由 XYL1编码的,作用时需要利用NADH或NAD- PH。第二步,在沙巴体育脱氢酶(XDH)的作用 下,将沙巴体育转化成D -木酮糖。XDH是由 XYL2编码的,需要NAD +或NADP +做辅酶因 子(图 3) 12。因此,将 P. stipitis 或 C. tropi-calls 中的基因XYL1转入S. cerevisiae 中,就可以 让S. cerevisiae 生产沙巴体育了。



众所周知,对于发酵木糖生产乙醇,酵母具 有独特的优势。在厌氧或低氧浓度条件下,以 NADH或NADPH作辅助因子,利用木糖还原酶 将木糖还原成沙巴体育,同时产生的NAD +或 NADPH则进入下_步代谢途径,这样最终的产 物是乙醇,而没有沙巴体育的积累。如果酵母菌不 以NADH作辅助因子,不产生NAD+,这样在木 糖的第一步代谢中就可以积累沙巴体育(例如De-baryomyces hansenii)。

4酵母中影响沙巴体育生产的因子

酵母生产沙巴体育的发酵工艺受一系列因子的 影响和控制。例如:底物浓度,碳源,接种量, 浴氧,温度或pH。

4.1木糖浓度

实验证明,影响酵母生长和发酵过程的一个重要因素就是木糖的底物浓度。培养基中木糖的 浓度可以影响沙巴体育的生产。可以承受高渗透压 或高葡萄糖浓度的酵母,在较高的木糖浓度下木 糖醇的产量较高。在提高发酵培养基木糖浓度的 同时,也要提高溶氧量,避免对菌体生长的抑 制。在对C. tropicalis菌株进行试验研究时发现, 在高木糖浓度条件下,通过选择溶氧量,使细胞 在发酵初期得到良好的生长,沙巴体育的生产效率 就会得到有效的提高。

4.2碳源

试验证明,C. tropicalis在低葡萄糖浓度条件 下菌体可以获得良好的生长,葡萄糖消耗完后可 以再利用木糖生产沙巴体育。这种情况在其他一些菌种中也存在,但是在 C. Guilliermondii M中还 没有证实是否存在这种相似的结果。

4.3氮源

在品种繁多的氮源中,酵母膏和尿素是酵母生产沙巴体育的最佳营养剂。在研究C. Bo—菌 株时这些氮源的促进左右得到了有效的证实。

4. 4接种囷龄

发酵工艺受接种菌龄的影响比较大,因为这 可以影响细胞的代谢活性和生存能力。用C.Guilliermondii 生产沙巴体育时,接种培养24h的菌 种,木糖浓度54. 5g/L时,其积累沙巴体育的能力 可达到 o^sgi—i-1。

4.5溶氧

氧是酵母代谢木糖的关键因子,在厌氧条件 下,由木糖生产沙巴体育的代谢途径被完全关闭。 不同菌种在代谢木糖时耗氧量均有不同。例如, C. Tropcalis在半厌氧条件下沙巴体育的产率最高; 在米用D. Hansenii 菌株做试验时也得到了同样 的结果。在采用葡萄糖培养细胞时,为了获得高 的细胞浓度,因此保证供氧量是必须的措施。

4. 6温度和pH

试验发现最佳的发酵温度是在30°C左右,有 轻微的温度波动不会影响对沙巴体育的代谢积累。 但是当温度超过37C时,沙巴体育的生产效率会大 大降低。不同的菌种对培养基的初始pH有不同的要求。D. Hansenii 的最佳 pH 是 5.5,而 C.parapsilosis, C. guilliemondii 和 C. Boidinii 生长的 最佳pH值是4. 5〜5, 6.0和7.0。

5提高酵母沙巴体育产量的方法

利用不同的酵母均得到了天然代谢产生的沙巴体育,特别是 Candida genera, C. boidinii, C. guilliermondii, C. parapsilosis, , C. pelliculosa, C. shehatae, C. tropicalis16 以及相近的 De- baryomyces hansenii 和 Pichia stipitis 菌种,比较适 用于沙巴体育的生产。

虽然这些酵母的活性及生产沙巴体育的能力都 很好,但是在工业规模上还是存在了很多问题, 例如木糖的价格很高、发酵的成本较高等。因此 还需要采取很多措施来进行改进、优化生产工 艺,例如优化细胞生长条件、控制溶氧及氧化还 原能力,采用复合底物或抑制沙巴体育脱氢酶基因 (XYL2)的表达,以增强木糖还原酶的活力。

这些改善、优化的方法是基于以下提出的: 5.1化学和物理诱变技术

这样可以增加生产沙巴体育的菌株的数量,可 以采用甲基硝基亚硝基胍、紫外射线等作为诱变 剂不断进行试验,然后通过特殊的培养基就可以 选出沙巴体育产量高的菌株。

5. 2基因工程技术

除了可以消耗木糖生产沙巴体育的野生菌株(例如 C. boidinii, C. guilliermondii, C. tropica- lis, C. parapsilosis, D. hansenii) 17 18 ,现在报道中常见的生产沙巴体育的酵母菌株还有两大类。 (1)通过破坏其中的乙醇脱氢酶(ADH)或木糖 醇脱氢酶(XDH),而将木糖转变成沙巴体育的菌株;(2)重组酵母。例如将P. Stipitis, C. tropi- calis或C. parapsilosis中的木糖还原酶基因XYL1 转入到S. 中。这都是基因工程技术有效应用的结果。

K〇和他的团队20-21近期发现,通过破坏木 糖醇脱氢酶基因XYL2,可以阻止沙巴体育向木酮 糖的转化。通过复合培养基(最有效的是甘油) 可以促进细胞的生长和NADPH的产生,最终在 发酵16h后沙巴体育积累的浓度就达到了 48. 6g/L。 这样方法的有效性在P. 3stipitis中也得到了证实。 沙巴体育脱氢酶(XDH)缺陷性菌株,破坏由 XYL3编码的D - xylulokinase后,沙巴体育的积累 量可达到SSg/L122。


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